內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)原理

鱟系海產(chǎn)動(dòng)物，生物學(xué)分類上屬節(jié)肢動(dòng)物門肢口綱劍尾目。在其血液中含有一種特殊的變形細(xì)胞（amoebocyte）。這種變形細(xì)胞中含有能被內(nèi)毒素激活的C因子、B因子、前凝固蛋白，因此，內(nèi)毒素檢測(cè)LT法（鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)）的機(jī)理即是內(nèi)毒素通過激活C因子、B因子、前凝固酶，而使可凝固蛋白變成凝固蛋白（肉眼可見的凝膠），從而可以半定量及定量地測(cè)知內(nèi)毒素的含量（圖1）。

日本學(xué)者在對(duì)可凝固蛋白氨基酸順序研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素激活的凝固酶的作用點(diǎn)為可凝固蛋白的第18（Arg）和19（Ghr）間的肽健，以及第46（Arg）和47 （G1y）間的肽鍵，而裂解為A鏈、B鏈及C肽。且在切斷部位的羧基端氨基酸的結(jié)構(gòu)均為-G1y-Arg，提出此酶的作用有特異性（圖2）。產(chǎn)色基質(zhì)內(nèi)毒素檢測(cè)法即是據(jù)此原理而設(shè)計(jì)的。

一般地講，內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是非常特異的，因此，LT法的假陽性極少。從革法蘭氏陽性菌分離出的肽聚糖雖亦能凝固鱟試劑，但其活性比內(nèi)毒素低1000~ 400000倍。

近來發(fā)現(xiàn)一種新的合成抗癌劑羧甲基（1→3）-β-D-葡聚糖亦能與鱟試劑起反應(yīng)。其反應(yīng)原理是：鱟試劑中含有一種稱為G因子的物質(zhì)，此抗癌劑能激活鱟試劑中的G因子，而活化的G因子又依次激活前凝固酶、可凝固蛋白，從而形成凝膠（圖2）。至此凝血酶、凝血激酶，Poly I:CPo1yA:U、核糖核酸酶、胰蛋白酶等，亦可凝固鱟試劑而引起假陽性反應(yīng)。但用氯仿處理此等物質(zhì)（浸取3～4小時(shí)）可以除去這些物質(zhì)，從而可避免發(fā)生假陽性反應(yīng)。

哺乳類動(dòng)物血漿中含一種酯酶，它對(duì)內(nèi)毒素有降解及脫毒的作用，故用LT法檢測(cè)血漿中的內(nèi)毒素易受此種物質(zhì)的影響，而造成假陰性結(jié)果。為了避免此等因素的影響，在試驗(yàn)前血漿需經(jīng)過特殊處理。目前共有下述四種方法處理血漿，即稀釋加熱法、酸化值液、氯仿浸取法及凝膠過濾法。我們及其它的一些工作者認(rèn)為稀釋加熱法簡(jiǎn)便易行，效果較好。

在鱟血液中，還有一種稱之為抗LPS因子（Anti - LPS - factor，ALF）的蛋白物質(zhì)，分子量約為15KDa，為一種鱟血抗凝劑，對(duì)LPS介導(dǎo)的LT反應(yīng)有直接的抑制作用。ALF可抑制LPS對(duì)LT反應(yīng)的初始.階段。因此在制備鱟試劑時(shí)，應(yīng)將此物質(zhì)清除。氯仿浸取法可有效去ALF。除去ALF及加入Ca++ （o.o2M）可改善鱟試劑的質(zhì)量，提高敏感性約100倍。