熒光測定法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法介紹

鱟試驗法中，有不少方法可以檢測細(xì)菌內(nèi)毒素含量，其中一種就是熒光測定法。

那熒光測定法在試驗中是怎么進(jìn)行操作的呢？

首先需要將熒光母素和鱟試劑充分混勻，這樣蛋白分子在進(jìn)行凝膠反應(yīng)的同時，熒光素就可以將其標(biāo)記上。

在凝膠逐漸形成的過程中，蛋白分子的聚合結(jié)構(gòu)也會慢慢發(fā)生變化，與此同時，與熒光素結(jié)合的蛋白因子也會跟隨水分子的運動從而進(jìn)行同步旋轉(zhuǎn)，使得熒光的偏光度會發(fā)生變化。這時，我們將熒光的偏光度設(shè)為P，垂直的熒光強(qiáng)度設(shè)為I1，水平的熒光強(qiáng)度設(shè)為I2,,然后可以看得出，P值會因為凝膠的凝固程度而發(fā)生變化，這個時候想要求出其中的值，可以根據(jù)下圖公式計算得出：

根據(jù)此公式可以得出，P值和供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量為線性關(guān)系。

在進(jìn)行鱟試驗時，熒光母素的常用濃度一般為0.02%，若熒光母素的濃度超過0.05%以上，蛋白分子的聚合結(jié)構(gòu)就會受到抑制，發(fā)生明顯的變化，而熒光母素的濃度在0.025%時，蛋白分子的聚合結(jié)構(gòu)會受到輕微抑制。所以，我們一般選定熒光母素的常用濃度為0.02%。

鱟試劑在凝固的過程中會隨時影響P值得變化。當(dāng)凝膠逐漸凝固時，P值就會越來越大，而內(nèi)毒素的濃度又決定了鱟試劑凝固的反應(yīng)期的時間長短和P值的增大變化。

當(dāng)內(nèi)毒素值為10-2μg/ml的時候，P值就會在五分鐘內(nèi)開始產(chǎn)生增大的變化；若內(nèi)毒素值在10-3μg /ml的時候，P值在30分鐘時都不會又明顯增大的變化；又若是內(nèi)毒素值在<10-3μg /ml的時候，因內(nèi)毒素的濃度值過小，鱟試劑凝固的反應(yīng)潛伏期就會越長。這個時候就能根據(jù)P值的上升程度繪制出圖像，從而得出回歸直線方程值。

這時，我們設(shè)傾斜度為b，潛伏期為t ，計算出b/t值。根據(jù)熒光母素濃度的不同計算出標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的值然后繪制成曲線圖像，可以得出內(nèi)毒素含量在10-8～10-3μg /ml范圍時，整體是呈上升直線狀的，可以得出相關(guān)系數(shù)：0.9804

由此列出方程式： 

Y = 0.0207 + 0.0797x，其中 (R = 0.9804)

由此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量

需要注意的是，熒光測定法的試驗操作均在0℃的環(huán)境中進(jìn)行操作，在進(jìn)行60分鐘靜置時，還需時刻觀察試驗的反應(yīng)過程，然后每5分鐘就需要進(jìn)行一次測定。

總而言之，熒光測定法需謹(jǐn)慎、耐心，方可得到準(zhǔn)確的結(jié)果。