選擇性清除內(nèi)毒素的最佳吸附條件

圖35-3顯示了從蛋白質(zhì)溶液中吸附內(nèi)毒素的原理。陰離子交換配體和一切內(nèi)毒素選擇性配體在工作條件下帶正電荷網(wǎng)，如此，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素在低離子力時(shí)被吸附，此時(shí)蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素幾乎不能回復(fù)。當(dāng)吸附能力耗盡之后（不取決于是否系內(nèi)毒素特異性），蛋白質(zhì)的回復(fù)便可接近100%。所采用配體的結(jié)合位點(diǎn)的多少對(duì)蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素來(lái)講是一樣多的，所以蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素對(duì)這些結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)影響了內(nèi)毒素的清除。同樣，對(duì)于一些已經(jīng)被吸附的內(nèi)毒素來(lái)說(shuō)，在蛋白質(zhì)濃度比內(nèi)毒素濃度高出6個(gè)數(shù)量級(jí)的情況下也是可以被取代下來(lái)的。

另一方面，內(nèi)毒素和帶陽(yáng)離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以致親和配體和蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)毒素，如果在吸附劑表面的電荷密度高或者使用一種選擇配體，使得平衡傾向于吸附劑，則可使內(nèi)毒素得到去除。當(dāng)帶陽(yáng)離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)從陰離子交換劑上解脫時(shí)，能得到幾乎100%的蛋白質(zhì)。

迄今為止，以上所提及的吸附劑沒(méi)有一個(gè)已被實(shí)際用于蛋白質(zhì)溶液的內(nèi)毒素清除。但是，離子力起到了重要的作用，特別是在吸附過(guò)程的最初階段。低離子力的物質(zhì)，相當(dāng)于小于50mmol/L的NaCl，常被推薦用作離子交換劑。具有較高離子力的物質(zhì)如多黏菌素B和DAH，在被用作親和吸附劑時(shí)，與配體的結(jié)合主要依靠離子間作用力和疏水作用。在合適的條件下，其關(guān)系常數(shù)超過(guò)109。多陽(yáng)離子配體較少依靠離子力。蛋白質(zhì)的去污染與其在環(huán)境條件下的等電點(diǎn)及pH值穩(wěn)定性有很大的關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，內(nèi)毒素能最大限度地被去除。強(qiáng)堿或強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)的化學(xué)特性使其在純化時(shí)發(fā)生不可逆的丟失，而且沉淀反應(yīng)也是一個(gè)問(wèn)題，所以必須尋找一個(gè)折中的辦法。對(duì)于酸性蛋白質(zhì)而言，環(huán)境pH值應(yīng)該盡可能接近PI，同時(shí)應(yīng)該采用多聚的或疏水性弱的配體。等電點(diǎn)接近7的蛋白質(zhì)應(yīng)該在pH≈PI的環(huán)境下進(jìn)行去污染。雖然用內(nèi)毒素選擇性配體能得到更好的結(jié)果，但陰離子交換劑也可以采用。離子交換劑對(duì)堿性蛋白質(zhì)的去污染結(jié)果也相當(dāng)不錯(cuò)，特別是帶有4條氨基酸基團(tuán)的配體，它在堿性條件下能顯示出較高的離子密度，并在提高pH值后與內(nèi)毒素的吸附相當(dāng)匹配。

應(yīng)該注意到，不僅僅是帶凈電荷的蛋白質(zhì)，也包括所有陽(yáng)離子配體，其電荷密度隨著pH值的改變會(huì)發(fā)生變化，但除外那些有4條氨基酸的配體。pH值的升高可導(dǎo)致電荷密度的減少，具體數(shù)值可因配體的pK或pI而有差別。

如果內(nèi)毒素和帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)之間的作用是由Ca2+介導(dǎo)的，則應(yīng)該輔以1～5mol/L的EDTA。EDTA是一種強(qiáng)螯合劑，可使蛋白質(zhì)-Ca2+-內(nèi)毒素復(fù)合物的平衡傾向于解離，由此增進(jìn)吸附劑的去污效果.此外，如果要采用輔以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不帶電荷的去污劑，則應(yīng)事先篩選，因?yàn)樵趹?yīng)用這些物質(zhì)時(shí)會(huì)帶來(lái)其他問(wèn)題。

評(píng)價(jià)層析柱在耗盡其蛋白質(zhì)結(jié)合能力之后留在柱里面的內(nèi)毒素的量是十分必要的，這在部分吸附時(shí)也是一樣的道理，即蛋白質(zhì)或內(nèi)毒素濃度的變化會(huì)同時(shí)影響到清除效率和蛋白質(zhì)的回收。