技術(shù)革新前沿：重組鱟試劑在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測中的突破性應(yīng)用

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法（BET）依賴于鱟試劑來檢測和定量藥物及醫(yī)療器械中的細(xì)菌內(nèi)毒素，傳統(tǒng)上采用來自鱟變形細(xì)胞裂解物的天然鱟試劑。然而，隨著市場對重組試劑需求的增長，以及針對天然鱟試劑存在的批次間差異、假陽性結(jié)果風(fēng)險及環(huán)境影響等問題，新型重組級聯(lián)試劑應(yīng)運而生。其中，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑作為全-球-首-款完整的重組級聯(lián)試劑，為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測帶來了革命性的改變。

一、PyroSmart NextGen®：革命性的重組級聯(lián)試劑

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑由三種酶凝因子——重組因子C（rFC）、重組B因子（rFB）以及重組凝固酶原（rPCE）組成，這些因子均源自T. tridentatus的克隆基因。這一創(chuàng)新設(shè)計不僅解決了傳統(tǒng)天然鱟試劑存在的問題，還顯著提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。它的出現(xiàn)，標(biāo)志著細(xì)菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的一大進(jìn)步。

▲重組鱟試劑

二、卓-越的分析性能

根據(jù)ICH Q2指南和USP 1225標(biāo)準(zhǔn)，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑經(jīng)過了嚴(yán)格的分析性能評估，包括準(zhǔn)確度、精確度、特異性、定量限、線性度和范圍等關(guān)鍵指標(biāo)，結(jié)果顯示，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑方法驗證的所有分析測試結(jié)果均符合驗收標(biāo)準(zhǔn)，與天然鱟試劑相比，具有相當(dāng)?shù)募嫒菪院瓦m用性。

（1）優(yōu)異的線性表現(xiàn)：

所有標(biāo)準(zhǔn)曲線均達(dá)到了USP<85>中規(guī)定的計算相關(guān)系數(shù)驗收標(biāo)準(zhǔn)（|r|≥0.980），表明其檢測結(jié)果與預(yù)期值高度一致（表1）。

▲表1.根據(jù)ICH Q2指南對PyroSmart NextGen®分析特性的評估

（2）高準(zhǔn)確性：

速率檢測和起始檢測的準(zhǔn)確性分別達(dá)到了84%至125%和71%至140%，均符合USP<85>的驗收標(biāo)準(zhǔn)（50-200%），保證了檢測結(jié)果的可靠性。

（3）重復(fù)性和中間精確度：

速率測定和起始測定的重復(fù)性分別在3%至21%和4%至30%之間，中間精確度的重復(fù)性也在7%至24%之間，均符合驗收標(biāo)準(zhǔn)，表明檢測結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性好。

（4）出色的重現(xiàn)性：

在不同批次或不同時間點的檢測中，速率測定和起始測定的可重復(fù)性分別在7%至17%和7%至22%之間，確保了檢測結(jié)果的一致性和可靠性。

（5）寬廣的檢測范圍：

在速率測定和起始測定中，檢測范圍分別覆蓋了0.00625至0.1EU/mL和0.005至50EU/mL，滿足了不同濃度內(nèi)毒素的檢測需求。

（6）定量限：

起始時間測定的定量限達(dá)到了最-低標(biāo)準(zhǔn)0.005EU/mL，且在此濃度下，準(zhǔn)確度和重復(fù)性均符合驗收標(biāo)準(zhǔn)，表明該試劑對內(nèi)毒素的檢測具有很高的靈敏度。

（7）特異性高：

特異性高：在有(1→3)-β-D葡聚糖存在的情況下，該試劑不發(fā)生反應(yīng)，表明其具有很高的特異性，避免了因其他成分干擾而導(dǎo)致的誤檢。（圖2）

▲圖2. PyroSmart NextGen®在含有和不含有(1→3)-β-D葡聚糖時對內(nèi)毒素反應(yīng)性的回歸分析

上圖：速率測定，下圖：起始測定

三、應(yīng)用案例

（一）各種注射劑和散裝藥物中的內(nèi)毒素檢測

按照藥典中BET所描述的干擾因素測試程序進(jìn)行回收測試,檢測了各種注射藥物對PyroSmart NextGen®重組鱟試劑及其他重組試劑和天然鱟試劑反應(yīng)性的干擾。

此外，還測試了阿昔洛韋、胰島素、PBS和WFI。使用四種重組試劑和五種天然鱟試劑測量了內(nèi)毒素回收率。需要對PyroSmart NextGen®重組鱟試劑的起始時間測定進(jìn)行優(yōu)化，以便僅對肝素鈣中的內(nèi)毒素進(jìn)行適當(dāng)測定,最小無干擾稀釋因子 (NID) 如表2所示。

▲表2.用重組試劑和天然鱟試劑測試的注射藥物的非干擾稀釋倍數(shù)（NID）

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑通過采用三因子級聯(lián)反應(yīng)機制，提高了對于幽門螺桿菌GU2內(nèi)毒素的反應(yīng)性，速率測定比前代產(chǎn)品提升了9.5倍，起始時間測定則提升了4.4倍（圖1），并在檢測多種注射劑和散裝藥物中的內(nèi)毒素時，展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力，其最小無干擾稀釋因子（NID）優(yōu)于同類產(chǎn)品，特別是在處理含有肝素鈣的樣本時表現(xiàn)更佳。

同時，相比天然鱟試劑和其他重組試劑，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑在抑制和增強因子抗性方面表現(xiàn)出色，具備更高的敏感性。

▲圖1. 用四種重組試劑和五種天然鱟試劑測定的不同內(nèi)毒素的效力比較

（二）水和大腸桿菌O113:H10:K陰性培養(yǎng)上清液中的自生內(nèi)毒素檢測 

通過檢測水和大腸桿菌O113:H10:K陰性樣本的培養(yǎng)上清液中的自生內(nèi)毒素，評估了PyroSmart NextGen®重組鱟試劑與天然鱟試劑的可比性。（圖3和圖4）

結(jié)果顯示，該試劑在檢測這些樣品中的自生內(nèi)毒素時，展現(xiàn)出了與天然鱟試劑相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和一致性，證明了其檢測能力可與天然鱟試劑相媲美。

▲圖3. 用四種重組試劑和五種天然鱟試劑測量的八個地方采集的去離子水中的自生內(nèi)毒素含量比較

▲圖4.使用四種重組試劑和五種天然鱟試劑對市售瓶裝水與大腸桿菌O113:H10:K (-)培養(yǎng)的上清液中的自生內(nèi)毒素水平的比較

四、總結(jié)

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑不僅克服了傳統(tǒng)重組試劑的一些限制，還提供了與天然鱟試劑相當(dāng)甚至更優(yōu)的性能表現(xiàn)。隨著2025年5月美國藥典（USP）第<86>章“使用重組試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素測試"的正式生效，這一先進(jìn)技術(shù)將在全球范圍內(nèi)得到廣泛采納。它為行業(yè)提供了一個更加可靠、環(huán)保的選擇，以支持更高質(zhì)量的安全標(biāo)準(zhǔn)。

未來，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用的深入拓展，PyroSmart NextGen®重組鱟試劑有望在細(xì)菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。