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鱟試驗方法——用產(chǎn)色基質(zhì)法檢測細菌內(nèi)毒素含量的方法

發(fā)布時間: 2022-08-11  點擊次數(shù): 824次

日本學者對內(nèi)毒素的產(chǎn)色基質(zhì)測定法Chromogenic subs-trate method進行了大量的研究。從試驗的反應(yīng)機理可知,試劑中含有一種特異的前凝固酶,其受內(nèi)毒素激活后變成有活性的凝固酶,后者具有α-凝血酶的活性及Xa因子及Xa因子的一些功能。這種酶可水解凝固蛋白原成三個片段,即A鏈、B鏈及C肽。A、B鏈和C肽再通過共價相聯(lián)而成為凝膠。此酶作用的部位,分別為A鏈羧基端的-Val-Leu-Gly-ArgGly,Arg 分別為第17、18C肽的-Val- Ser-G1y-ArgG1y,Arg分別為第45、46上,提示羧基末端Gly-Arg的結(jié)構(gòu)可受到血凝固酶的作用。鑒于此,利用人工合成的肽-硝基苯胺.肽一PNA或肽-4甲基香-豆素酰胺(肽-MCA基質(zhì)中肽段氨基酸排列順序與凝固蛋白質(zhì)切斷部位的氨基酸排列順序相同的特性,就可以由于這種酶的水解作用,使產(chǎn)色基質(zhì)游離出來,即可用分光光度計于適當?shù)牟ㄩL處測得吸光度。

 

如用肽-PNA基質(zhì)則釋出的為PNA,可在405nm處測定吸光值。如用肽-MCA基質(zhì),即釋出7-氨基-4-甲基香-豆素AMC經(jīng)380nm波長紫外線激發(fā)后,460nm處可測得熒光,如用370nm波長亦可測知AMC的游離量。

 

目前應(yīng)用的產(chǎn)色基質(zhì)許多種,主要有:

Bz - lle - Glu - Gly -Arg - PNA

Bz - Val - Gly - Arg - PNA

Boc - Lue - Gly - Arg -PNA

Boc - Lue - Gly - Arg - PNA

Boc - Ser - Gly - Arg - PNA

Boc - Leu - Gly -Arg - MCA

Boc - Ser - Gly - Arg- MCA等。

 

這些基質(zhì)對凝固酶的酰胺酶感性內(nèi)毒素濃度的提高和作用時間的延長而增強顯示其高度的專一性。測出內(nèi)毒素范圍5Pg-50ng/ml。反應(yīng)時間延長測得更低的內(nèi)毒素值。反應(yīng)需要的最適pH8.08.5。

 

在試驗時必須作陽性標準管,即以一定濃度0.1000.025,0.075ng/ml的標準內(nèi)毒素與肽-PNA或肽-MCA反應(yīng),然后作出線性標準曲線。作出的標準曲線,其相關(guān)系數(shù)應(yīng)>0.98,變異系數(shù)<5 %。被檢樣品的吸光值只要與標準曲線比較,即得知標本中所含的內(nèi)毒素量。亦可采用下列公式求得如下圖:

 

 

如果要測定血漿或血清中的內(nèi)毒素,則由于其中含有內(nèi)毒素抑制蛋白,可事先加熱3730分鐘,以破壞這些抑制物質(zhì),或通過稀釋的方法消去這些抑制物質(zhì)。亦可在血清中加入標準內(nèi)毒素作出標準曲線。

 

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