特異鱟試劑制備的方法

自從1981年日本學(xué)者Kakinuma A 等報(bào)道“一種抗癌物質(zhì)( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使鱟試劑凝聚"以來(lái)，由于其涉及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的特異性，引起各國(guó)學(xué)者的注意。

一、（1-3）-β-D-葡聚糖的本質(zhì)與來(lái)源

Kakinuma A等在作抗癌物質(zhì)葡聚糖熱原試驗(yàn)時(shí)，不含發(fā)熱物質(zhì)的葡聚糖能引起鱟試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)。Loretta A和Pearsen FC也報(bào)道，血液透析器上存在鱟試驗(yàn)反應(yīng)物質(zhì)（LAL-Reactive Materia l，LAL-RM），以后有報(bào)道凡經(jīng)過(guò)銅銨人造絲透析膜的制品，均存在使鱟試驗(yàn)陽(yáng)性，但不是內(nèi)毒素的物質(zhì)。1983年日本學(xué)者中村隆范報(bào)道了這一物質(zhì)具有如下結(jié)構(gòu):

除（1-3）-β-葡聚糖外，（1-4）、（1-6）-β-葡聚糖同樣使鱟試驗(yàn)產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果，這些物質(zhì)的總稱為真菌多糖（Fungal polysaccharide），普遍存在于真菌細(xì)胞壁。如果這類物質(zhì)具有像內(nèi)毒素一樣的致熱活性，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和熱原檢查結(jié)果的符合率會(huì)接近一致。但是恰恰相反，真菌多糖似乎不是一種致熱物質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道1.0、0.01、0. 0001mg/mL的真菌多糖溶液，劑量按10mL/kg，進(jìn)行熱原試驗(yàn)的結(jié)果，3h內(nèi)3只家兔最高升溫的均值分別為0.23±0.03，0.13±0. 09，0.20±0.10。這將導(dǎo)致在使用普通鱟試劑檢測(cè)某些樣品時(shí)，出現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查不合格，熱原檢查合格的現(xiàn)象。造成對(duì)這些物質(zhì)熱原檢查的錯(cuò)判。1990年Ikemura K等將鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理和各種干擾內(nèi)毒素檢查物質(zhì)及干擾部位歸納如下:

由此可知，鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素出現(xiàn)非特異性結(jié)果是不奇怪的。為了使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查與熱原檢查的結(jié)果趨向一致，使用特異鱟試劑是*必要的。

二、特異鱟試劑制備

1968年Levin J和Bang F B創(chuàng)建鱟試劑以來(lái)，使內(nèi)毒素的檢測(cè)成為靈敏、快速、簡(jiǎn)便的方法，已被舉世*，并被美、日、中、歐洲藥典以《細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)》收載，但是由于上述非特異性的存在，使這一試驗(yàn)的實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。為了克服這一弊端，各國(guó)學(xué)者進(jìn)行了深入研究。由于上述鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理已被闡明，設(shè)法阻止右側(cè)旁路反應(yīng)，便能使鱟試劑對(duì)內(nèi)毒素的檢測(cè)達(dá)到特異性的目的。

日本最先推出的特異鱟試劑其商品名為En-dospecy其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)是將普通鱟試劑中存在的G因子，以親和層析方法分離去除。國(guó)內(nèi)有人稱無(wú)（棄；去）G因子鱟試劑。顯然，鱟試劑中沒(méi)有G因子，即使被測(cè)樣品中存在真菌多糖（非內(nèi)毒素），也不能產(chǎn)生活化的G因子，在反應(yīng)旁路系統(tǒng)中就不能激活凝固酶原，旁路反應(yīng)被阻斷，使成為對(duì)內(nèi)毒素具有特異性。

國(guó)內(nèi)吳偉洪等報(bào)道，以同樣方法制備了僅含C、B因子的鱟試劑。但是以這種工藝制備的特異鱟試劑，由于在分離G因子的過(guò)程中，必需防止帶入微量?jī)?nèi)毒素，即所用分離試劑、柱床、器皿及操作過(guò)程，嚴(yán)防內(nèi)毒素污染，不僅增加了制備工藝的難度，也必然增加鱟試劑的成本，因此很難推廣應(yīng)用。

1989年Berzofsty R N報(bào)道，在制備普通鱟試劑時(shí)，為了提高檢測(cè)內(nèi)毒素的靈敏度，均采用氯仿提取存在于鱟試劑粗制品中的抗LPS（脂多糖）因子。氯仿提取的結(jié)果確實(shí)增加了鱟試劑的靈敏度，但同時(shí)將存在于鱟試劑粗制品中的抗G因子一同除去，這就使普通鱟試劑易被真菌多糖激活，增加了普通鱟試劑的非特異性。因此提出不用氯仿提取，改用一種特殊試劑，只除去抗LPS因子，而保留抗G因子，以達(dá)到即增加了對(duì)內(nèi)毒素的敏感性，又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。這是從鱟試劑的生產(chǎn)工藝上進(jìn)行改革，實(shí)現(xiàn)提供商品特異鱟試劑的一種方法。

1990年 Tsuchiya M報(bào)道，由于真菌多糖與普通鱟試劑反應(yīng)形成凝膠，有一個(gè)特定濃度范圍（10 ^-3~10^-6mg/mL），大于或小于這個(gè)濃度都不能成膠，故在制備普通鱟試劑的基礎(chǔ)上，加入過(guò)量的真菌多糖( 1mg/mL)，可阻止G因子的活化，即“封閉"了旁路，達(dá)到制備特異鱟試劑的目的。顯然采用這一措施制備特異鱟試劑，較以上兩種方法既簡(jiǎn)便又經(jīng)濟(jì)，可使特異鱟試劑商品化。